Por Philip Ball | Chemistry World
01.Dezembro.2023
Uma equipe internacional de pesquisadores usou cristalografia ultrarrápida com resolução temporal para acompanhar o progresso do reparo do DNA por uma enzima fotolíase. O trabalho é “a primeira caracterização estrutural de um ciclo completo de reação enzimática”, diz Manuel Maestre-Reyna, que liderou a pesquisa.
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Embora muitas das fases deste processo já tenham sido estudadas antes, a nova investigação vai significativamente mais longe “ao visualizar a coreografia tanto do substrato como da enzima”, diz o biólogo molecular Aziz Sancar, da Faculdade de Medicina da Universidade da Carolina do Norte, que foi laureado com o Prêmio Nobel de Química de 2015 por seu trabalho em estudos mecanísticos de reparo de DNA. Em particular, o estudo superou o desafio de capturar eventos que ocorrem em escalas de tempo muito diferentes para mapear cada etapa enzimática do processo.
Sancar chama isso de “trabalho notável, ultrapassando os limites da cristalogra com resolução temporal”.
▪️ ‘As enzimas são lentas’
As fotolíases reparam danos no DNA causados pela luz ultravioleta em bactérias, fungos, plantas e alguns animais, incluindo marsupiais.
Os humanos e outros mamíferos não contêm estas enzimas, mas nós também sofremos danos induzidos pela luz.
Um resultado comum é a formação de dímeros de ciclobutano pirimidina (CPDs), onde duas bases pirimidinas adjacentes (timina ou citosina) se fundem através de um anel ciclobutano de quatro membros.
“A formação de CPD é a principal causa do cancro da pele, e a pele queimada pelo sol contém sempre lesões de CPD”, diz Maestre-Reyna, bioquímico do Instituto de Química Biológica de Taipei, Taiwan.
A enzima repara o DNA mantendo o CPD em seu sítio ativo, enquanto uma coenzima flavina adenina dinucleotídeo (FAD) transfere um elétron para o anel ciclobutano em um processo que é estimulado pela luz. Isso desencadeia uma reação de radicais livres que corta as duas ligações carbono-carbono que mantêm as pirimidinas unidas.
Fonte: © Ciência/AAAS
As etapas do reparo abrangem escalas de tempo de pico a nanossegundos, tornando um desafio capturar todo o processo de ponta a ponta.
Tudo isso acontece rapidamente quando o FAD é ativado: a transferência inicial de elétrons acontece após 100ps, e a segunda ligação C – C se quebra após cerca de 1ns. Mas então são necessários cerca de 500 ns para que o sítio ativo da enzima retorne ao seu estado inicial, e mais 200 μs para que as pirimidinas reparadas saiam do sítio ativo e o DNA seja liberado.
“As enzimas são lentas”, diz o biofísico Marius Schmidt, da Universidade de Wisconsin-Milwaukee. ‘Os ciclos catalíticos são concluídos na escala de milissegundos, mas os eventos fundamentais, como a formação de ligações e os relaxamentos locais, são extremamente rápidos. Estas duas escalas de tempo são difíceis de conciliar.»
Para acompanhar todo o processo, Maestre-Reyna e seus colegas realizaram cristalografia ultrarrápida em co-cristais de uma fotolíase microbiana e DNA contendo CPD, usando duas fontes de laser de elétrons livres (FEL) de raios X brilhantes. Uma equipe, trabalhando na Suíça, coletou dados dos primeiros 10 ns da reação, enquanto a outra equipe, utilizando um FEL no Japão, estudou o relaxamento do complexo enzimático e a liberação do DNA de 10ns a 200μ.
Tivemos que purificar a proteína, ativá-la, cocristalizá-la, colher os cristais e coletar os dados em 20 horas.
O principal desafio, diz Maestre-Reyna, foi que as equipes tiveram que trabalhar rápido para coletar os dados. “As fotolíases só são ativas na sua forma totalmente reduzida, por isso todos os experimentos tiveram que ser realizados em condições livres de oxigênio”, diz ele. E como a forma reduzida é facilmente oxidada, eles estimaram que teriam apenas cerca de 20 horas antes que ela fosse novamente desativada.
“Tivemos que purificar a proteína, ativá-la, cocristalizá-la, colher os cristais e prepará-los para a coleta de dados e, em seguida, coletar os dados, tudo no local em no máximo 20 horas”, acrescenta.
Maestre-Reyna ressalta que o trabalho só foi possível com uma grande equipe multidisciplinar.
Isso incluiu Ming-Daw Tsai no laboratório de Taiwan, que trabalhou extensivamente na base estrutural do reparo de DNA, Lars-Oliver Essen da Philipps University Marburg (‘um dos mais importantes cientistas da fotolíase do mundo’), Junpei Yamamoto da Universidade de Osaka (‘possivelmente o único químico sintético do mundo capaz de produzir DNA fotodanificado nas enormes escalas necessárias’) e Antoine Royant da Universidade de Grenoble Alps, especialista em realizar espectroscopia em cristais.
Um componente chave, mas até agora pouco compreendido, da reação é um aglomerado de cinco moléculas de água dentro do sítio ativo.
Este aglomerado, ligado por ligações de hidrogênio a uma parte da proteína, parece ajustar a afinidade do sítio ativo pelos CPDs e permite-lhe reorganizar-se rapidamente quando ocorre a transferência inicial de eletrões – uma ideia anteriormente especulativa que o novo trabalho confirma.
Maestre-Reyna também diz que “embora tenhamos entrado armados com um conhecimento muito bom do que esperar durante o primeiro nanossegundo ou mais, o que aconteceria mais tarde [quando as bases fossem libertadas] era um território muito desconhecido”.
[Ênfase adicionada]
Referências:
M Maestre-Reyna et al, Science, 2023, 382, eadd7795 (DOI: 10.1126/science.add7795
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